李三才考中进士，从而“束发登朝”，经过初期培训，授职户部主事。六年后，江苏无锡人顾宪成也来到户部当主事，他们的上司是赵南星。顾宪成姿性绝人，幼即有志圣学，万历四年中乡试第一名，万历八年中二甲第二名进士。李三才与同僚顾宪成、魏允贞、李化龙意气相投，成为终生的挚友。他们都是才华横溢，年轻气盛，初涉仕途，想大显一番身手，于是相互鼓励，“以名世相期许”。
顾宪成向来不把权贵放在眼里。首辅张居正生病，朝臣群起为他祈祷，顾宪成拒绝参与，有同僚代他签名，他拿笔去掉。一次，大臣王锡爵对顾宪成抱怨：“当今所最怪者，庙堂之是非，天下必欲反之。”顾宪成立即反唇相讥：“吾见天下之是非，庙堂必欲反之耳！”
万历十一年（1583年），身为御史的魏允贞看不惯阁臣张四维、申时行的儿子在科举中都题名金榜，就疏劾张、申“不当以甲第私其子，蹈故相张居正覆辙”。
当年的首辅张居正权倾朝野，他的长子敬修进士及第，授礼部主事；次子嗣修榜眼，授翰林院编修；三子懋修状元及第。
有个马屁精送给张府一副对联，上面写道：
上相太师一德辅三朝功光日月；
状元榜眼二难登两第学冠天人。
张居正欣然将其挂在家中，得意洋洋。
当张居正万历十年去世时，北京城内流传着一句民谣：“张公若不身亡，四官定作探花郎。”因为第二年将逢春闱，要不是张居正遽然去世，人们臆测其四子简修一定会在本年度的春闱中高中。
明神宗朱翊钧袒护大臣，魏允贞受到严旨切责，并左迁外官。
李三才为此打抱不平，公开站出来替魏允贞辩护，敢和首辅张四维顶牛，同样也被降职为山东东昌的推官。
在东昌的任内，李三才雷厉风行，治尚威严，颇得民心，渐升任山东省按察使佥事，分管全省司法大事。辖内多土匪地痞，搅扰一方，百姓不得安宁。多年来地方官束手无策，只能听之任之。李三才到任后，“广设方略，悉擒灭之”。
某日傍晚，李三才带了家仆益善微服私访，看见河滩上聚集了很多人，情绪激愤，有的跳脚骂人，有的唉声叹气，还有悲惨的恸哭声。李三才依稀听见妇人泣诉：“我苦命的儿啊！你被那个畜生糟蹋了，娘会和你爹去官府告状，为你报仇雪恨。你咋想不开跳河，让你娘你爹怎么活啊！”
忽一阵惊呼：孩她娘，你醒醒！”
李三才心想：“那妇人大约晕过去了。拼命挤进人群，发现一个胡子拉碴的男子搂着中年妇女揉胸捶背，唏嘘不止。地上躺着一具女尸，虽然乌发凌乱，脸色煞白，双眸紧闭，但秀丽的五官，苗条的身段，可以想象，此女生前必定美貌异常。
李三才拉着一个老汉询问：“大叔，请问这是怎么回事？”
“唉，造孽啊！这个女孩儿今年才十六岁，已经许配人家，不料遭一名太监强奸，因羞辱而投河自尽。那是她的爹娘。”
李三才闻言义愤填膺，破口大骂：“这条阉狗，刑余之人，竟敢淫辱少女致死，我看他活够了！”
“现在就这世道，好人不长寿，祸害活千年。有啥办法呢？”
李三才大声说：“不！煌煌盛世，朗朗乾坤，焉能让这种阉宦横行无忌，我一定要把他绳之以法，以命偿命。”
老汉讶问：“您是什么人？口出大言？”
“我——”
益善插嘴：“不瞒大叔，他就是山东按察使佥事李大人。”
“什么，是李大人？哎呦，可遇上青天大老爷啦！”老汉马上向李三才跪倒，苦主和在场的所有人全都跪下了。
李三才跺脚道：“都起来，不要多礼，有话慢慢说。”
“谢大人！”
人们站起身来，苦主膝行向前，泣呼：“李大人，小女死得太惨，求求您，为草民做主啊！”
“本官一定为你们申冤报仇，你们快起来。”
“是。”
老汉担忧地问：“李大人，那阉狗是钦差，代天子出巡，您杀得了他吗？”
“本官确实不能直接杀了他，但可以上奏参他一本，揭露他的罪行，皇上一定会依照国法处死这个畜生。”
“对对对，皇上一定会替我们老百姓做主的，那阉狗不得好死！”
李三才从袖中取出一只银锭对苦主说：“大哥、大嫂，请你们节哀保重，这十两银子给孩子办后事吧！”
李三才安抚了死者家属后，即刻回府，连夜将此事奏闻朝廷，要求皇上严惩罪犯。
朱翊钧准奏，下旨命李三才将这名阉宦逮捕，在济南闹市区斩首示众，以儆效尤。
李三才惩恶扬善之举，威震山东，以致“二十年后，民犹思之”。
随后的十几年，李三才在仕途上屡有升降，任过河南参议，晋为副使，先后两次管理山东、山西学政，最后被提拔为南京通政司参议，召任大理寺少卿。李三才在《秋夜宿直》一诗中，表达了自己郁郁不得志的苦闷：
十载犹郎署，蹉跎愧少年。
凉风回树杪，白露下庭前。
漏度三更雨，灯残五夜烟。
由来飞动意，回首欲茫然。
是金子总会发光。
万历二十七年（1599年），李三才以右佥都御史总督漕运，并巡抚淮、扬、庐、凤四府和徐、和、滁三州。
京杭大运河北起北京，南至杭州，横跨北京、天津、河北、山东、江苏、浙江六省市，沟通海河、黄河、淮河、长江、钱塘江五大水系，是中国古代伟大的水利工程，也是世界历史上最古老的人工大运河。
淮安扼漕运、盐运、河工、榷关、邮驿之机杼，府治于山阳县。与扬州、苏州、杭州并称运河沿线的四大都市，有中国运河之都的美誉。漕运总督衙门就设在淮安。
漕，水运也。由沿海省份征收粮食，沿运河直达都城，故称漕粮。历朝都十分重视漕运，以其为国家经济的命脉。自隋代开凿大运河，朝廷就在淮安设漕运专署，宋设江淮转运使，东南六路之粟皆由淮入汴而至京师。
明永乐二年（1404年），设武职漕运总兵，为正二品衔，率十二万军队，专门负责漕运。明景泰二年（1451年），设漕运总督，是朝廷派出统管全国漕运事务的最高官员，品级为从一品或正二品。属官有理漕参政、巡漕御史、郎中、监兑、理刑、主事等二百七十多人，还下辖仓储、造船、卫漕兵丁两万余人。
漕运总督是文职，与总兵同理漕务，称为文、武二院。但总兵的职权居总督之上。总兵与总督之间往往会矛盾重重，甚至闹得不可开交，以至朝廷不得不加以干预。
李三才任漕运总督，与总兵王承勋共理漕务。王承勋是伯爵（世袭新建伯）王守仁的孙子，资历浅，才力懦，李三才“以气凌驾之”，加上王承勋犯过小错误，不仅不敢居李三才之上，反而十分敬惮李三才，主动“移坐其下”。
不久，李三才趁热打铁，上奏万历皇帝，请求裁撤这种凭空增加办事环节、叠床架屋的官职，制约总督公务。朝廷批准裁撤漕运总兵官，专任漕运总督。
李三才开创了漕运总督总揽漕运事宜的新体制，避免了漕运总兵官与漕运总督的权力之争。此后，明末和整个清代三百余年间的漕运，全部实行的是漕运总督总揽漕运事宜的体制。这是李三才在治理漕运上的最大贡献。
